Monumentale esempio di architettura medievale, accoglie le reliquie di Santa Giustina e San Luca.  
Il grandioso e celebre tempio di Santa Giustina, che secondo alcuni studiosi sorgerebbe sulle rovine di un tempio pagano, è la più importante opera architettonica di Padova e il più antico luogo di culto della città. La chiesa, straordinariamente affascinante per la sua posizione laterale ed asimmetrica rispetto a Prato della Valle, venne fondata intorno al V secolo su un luogo cimiteriale in memoria della martire Giustina, giovane patrizia cittadina martirizzata nel 304 nella feroce persecuzione di Massimiliano. Secondo la tradizione il padre della martire, Vitaliano, alto funzionario imperiale convertito al cristianesimo da San Prosdocimo, fece costruire il primo nucleo della chiesa che sarebbe diventata la sede della prima cattedrale della città cristiana. Alla Chiesa fu annesso successivamente un monastero benedettino e il complesso si arricchì progressivamente di beni e reliquie. Dopo la ricostruzione a seguito del terremoto del 1117, la chiesa fu demolita nel 1502 per dar posto all'attuale colosso, realizzato tra il 1532 e il 1579 da diversi architetti, e in particolare da Andrea Moroni e Andrea da Valle.
La facciata, che sarebbe dovuta essere ricoperta di marmo bianco, non fu mai portata a termine. Sulla gradinata si possono ammirare due grifi in marmo rosso di Verona appartenenti al portale duecentesco.
Furono inoltre necessari 85 anni per arrivare alla copertura del tetto che richiese enormi quantità di denaro e di materiali. Per queste ragioni, quando si pensa ad un lavoro interminabile, si dice nel dialetto locale: "...longo come a fabrica de Santa Giustina". La facciata in ruvida pietra è entrata a pieno titolo nell'immagine acquisita, aiutata dall'orizzonte delle otto cupole che le danno un aspetto rotondeggiante, e dal campanile poggiante sul predecessore medievale, che domina la vastissima mole della Basilica.
L'interno, vasto e luminoso, uno dei massimi capolavori dell'architettura rinascimentale, è a croce latina e si presenta diviso da grandi pilastri in tre navate. La luce entra attraverso le cupole finestrate. Per dimensioni (122 metri di lunghezza) Santa Giustina è la nona tra le chiese del mondo, segnata anche nel pavimento della Basilica di S. Pietro a Roma.

Partendo dalla navata di destra, dietro l'Arca di San Mattia si apre un suggestivo passaggio per il Pozzo dei Martiri (1566) dove sono raccolte tutte le reliquie dei martiri padovani, ornato da quattro statue in terracotta; sulla destra una gabbia in ferro che conteneva le reliquie di San Luca. Di qui giungiamo al Sacello (piccola cappella votiva) di S. Prosdocimo con ricche decorazioni marmoree e musive (di mosaico).
Tornati in chiesa attraverso il transetto e la cappella dedicata a San Massimo nota per il movimentato gruppo marmoreo di Filippo Parodi raffigurante la Pietà, si accede alla trecentesca Cappella di S. Luca. L'ancona (tavola dipinta) di Andrea Mantegna che era posta sopra l'Arca di San Luca, opera pisana del 1316 con bellissimi rilievi in alabastro, fu asportata da Napoleone e oggi si trova alla Pinacoteca Brera di Milano. Una lapide in marmo nero ricorda la sepoltura della veneziana Elena Lucrezia Cornaro Piscopia, prima donna laureata nel mondo (1678). Attraverso il Coro vecchio, che era l'abside della chiesa precedente (1462), con 50 stalli e sedili in noce, si accede all'antisagrestia, dove è custodito l'architrave del portale romanico della basilica vecchia (1080 circa). La sagrestia racchiude arredi lignei seicenteschi.
Notevolissimi gli intagli e i decori del cinquecentesco coro, dove la pala (Martirio di S. Giustina, 1575 circa) all'altare di fondo è di Paolo Veronese.
Il ricco monastero, che in passato accolse personaggi illustri e papi, fu soppresso da Napoleone nel 1818 e trasformato in caserma e ospedale militare. Ritornò ai monaci nel 1919 e fu eretto nuovamente in Abbazia nel 1943. E' possibile visitarne il Chiostro del Capitolo, costruito nel XII secolo in stile romanico e il Chiostro Maggiore, chiamato anche Chiostro Dipinto per i molti affreschi che lo decoravano. La biblioteca monastica medioevale, con i suoi arredi, i suoi scaffali scolpiti in legno pregiato, le ricche tappezzerie, le raccolte d'arte, incrementate da lasciti e donazioni, e i suoi 80.000 volumi, aveva raggiunto l'apice nel XVIII secolo, ma a seguito di un decreto di Napoleone fu soppressa. Gli scaffali furono portati nella Sala dei Giganti della Reggia Carrarese, ora Liviano, ma purtroppo furono tanti i libri e i capolavori d'arte dispersi.